Aquí hay algunos factores que afectan la cromatografía de fase inversa.
Rendimiento del sistema:
El rendimiento se considera un factor importante en la resolución de analitos pequeños, incluidos los digeridos de proteínas y los péptidos pequeños en las separaciones de fase inversa.
La longitud de la columna utilizada:
La longitud de la columna afecta el tiempo de retención. Si reduce la longitud de la columna, la RT de la molécula también disminuye proporcionalmente.
Temperatura del sistema:
La temperatura puede tener un efecto intenso en la RP-HPLC, especialmente para moléculas de bajo peso atómico. La viscosidad de la fase móvil utilizada en la cromatografía de fase inversa disminuye a medida que aumenta la temperatura de la columna de HPLC. Como el transporte de masa de moléculas es un proceso controlado por difusión entre la fase estacionaria y la fase móvil, la baja viscosidad del disolvente generalmente conduce a una transferencia de masa muy eficiente y, por lo tanto, a una alta resolución.
El método de elución en gradiente:
En algunas biomoléculas y analitos se deben utilizar métodos de elución en gradiente porque son difíciles de separar o hay más componentes en la muestra. Los métodos de elución en gradiente pueden afectar algunas separaciones por cromatografía de fase inversa.
La fase móvil del sistema:
La fase móvil de la cromatografía de fase inversa consta de fases orgánicas y acuosas como metanol, acetonitrilo, agua y tampón. Sin embargo, las soluciones de fase móvil tienen capacidades de amortiguación leves porque generalmente tienen un ácido fuerte a pH bajo con grandes cantidades de solventes orgánicos. Mientras se trabaja cerca de condiciones fisiológicas, se debe mantener una capacidad de amortiguación adecuada.
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