Cuidado y mantenimiento de la columna HPLC

cromatografia liquida

La columna es una pieza tan esencial para la separación en cromatografía líquida de alto rendimiento, por eso es necesario el cuidado y mantenimiento adecuados de la columna para un mejor rendimiento y una vida útil más larga. Todos los cromatógrafos saben la importancia de las columnas en el análisis HPLC, puesto que la resolución, el número teórico de placas, la simetría máxima, el factor de colocación y la adecuación del sistema dependen del rendimiento de la columna.

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Acondicionamiento de la columna:

Cada columna HPLC de fase inversa debe condicionarse por primera vez, después del almacenamiento a largo plazo y cuando se produzcan cambios significativos en la fase móvil. La fase móvil utilizada en el acondicionamiento debería ser similar a las utilizadas en la consiguiente cromatografía.


El procedimiento general de acondicionamiento de columnas es el siguiente:
1. Lavar la columna con unos 3 volúmenes de columna de Fase móvil acuosa con un caudal bajo.
2. Ejecute un sistema de gradiente lineal desde la fase móvil 100% acuosa hasta la fase móvil 100% orgánica hasta un volumen de 2-3 columnas con el mismo caudal que el anterior.
3. Equilibre la columna en un mínimo de 5 volúmenes de columna con la fase móvil orgánica, hasta que las señales del monitor se estabilicen.
4. Si cambia el sistema de fase móvil, debe realizarse una prueba en blanco para verificar cualquier impureza que pueda surgir en la fase móvil.

Limpieza de columnas:

La limpieza regular de la columna HPLC es esencial, especialmente cuando se trata de muestras con contaminantes contaminantes y partículas de la columna. El aumento de las contrapresiones, la fluctuación de la línea de base y la pérdida de resolución son signos de que la columna puede requerir limpiarse. En los medios de fase inversa a base de sílice, el pico tiene una resolución de pérdida debido a la marca del pico y también puede ser causado por la disolución de la matriz durante el uso habitual de la fase móvil o el tampón de pH superior a 7.
Un procedimiento típico para limpiar una columna HPLC es el siguiente.

  • Todo el disolvente utilizado en el análisis debe ser de grado HPLC y filtrado a través de la membrana del filtro de nylon de 0,45 micras y también es necesaria la desgasificación.
  • Equilibre la columna en un caudal bajo con varios volúmenes de columna de fase móvil que contengan agua de grado HPLC.
  • 100% - 20 volúmenes de columna de agua
  • 50:50% - 20 volúmenes de columna de agua: acetonitrilo o metanol
  • 100% - 20 volúmenes de columna de acetonitrilo o metanol. Las soluciones tampón son muy perjudiciales para el rendimiento y la vida útil de la columna, por tanto, lavar la columna con un volumen adecuado de agua, por lo que la sal no se acumule en la columna y en el sistema.

Almacenamiento de columnas:

Las columnas de fase inversa se basan en gel de sílice, por lo que no deben almacenarse en una solución acuosa. Esto se debe a que la sílice tiene inestabilidad inherente en condiciones acuosas. Las columnas de fase inversa a base de sílice se almacenan generalmente en disolventes orgánicos puros, por ejemplo, metanol, que debería estar libre de aditivos o TFA.

Regeneración de la columna de fase inversa:

Las columnas RP-HPLC incluyen fases estacionarias C8, C18, CN C1, C30, C4 y fenil. Para lavar y generar la columna, lávala con los siguientes disolventes.

  • 20 volúmenes de columna de 95:5% de agua: acetonitrilo (v/v)
  • 20 volúmenes de columna de 100% de acetonitrilo
  • 5 volúmenes de columna 100% de isopropanol
  • 20 volúmenes de columna 100% de hexano
  • 5 volúmenes de columna 100% de isopropanol
  • 20 volúmenes de columna 100% de acetonitrilo
  • 20 volúmenes de columna de agua: acetonitrilo (95:5 v/v)

Tras lavarse con esta secuencia de disolventes, la columna debe volver a equilibrarse con la composición de la fase móvil.

Puntos importantes:

Dado que casi el 90% de la separación funciona mediante cromatografía en fase inversa (RP-HPLC), a continuación se enumeran algunos puntos importantes a tener en cuenta para proteger y mejorar la vida y el rendimiento de las columnas HPLC.

  • Instale correctamente la columna cuando la cambie o la sustituya.
  • Confirme la eficiencia de la nueva columna suministrada por el vendedor.
  • La columna debe estar protegida de golpes, golpes y golpes mecánicos.
  • Para protegerse de las impurezas y otras partículas extrañas, utilice siempre una columna de protección.
  • Utilice siempre disolventes de grado HPLC (metanol, acetonitrilo y agua, etc.) para el análisis.
  • Para excluir impurezas y partículas extrañas, filtre la fase móvil con 0,45 μ y antes de inyectar la muestra filtre la muestra con un filtro de membrana de 0,20 μ.
  • Desgasificar todas las fases móviles y muestras antes de utilizarlas para su análisis.
  • Utilice siempre una solución tampón recién preparada (fosfato, acetato y formiado, etc.) para el análisis.
  • Antes de inyectar la muestra, saturar la columna con la fase móvil.
  • No sobrecargue la columna de HPLC, dando lugar a picos amplios de analitos.
  • Si hay un horno de columna disponible, mantenga la temperatura de la columna y también la temperatura ambiente.
  • Mantenga siempre el pH de la fase tampón/móvil en el rango de 2,0 a 9,5 pH.
  • Evite utilizar un tampón viscoso. Las concentraciones de tampón fosfato deben ser inferiores a 20 mM.
  • Evite inyectar la muestra muy ácida y básica en el bucle de muestra, neutralice siempre la muestra.
  • No inyecte muestras biológicas directamente en el inyector HPLC.
  • Evite cualquier fluctuación repentina de presión durante el análisis.
  • No trabaje con caudales elevados, genera presión
  • Compruebe periódicamente el rendimiento de la columna con los estándares y no haga funcionar el sistema HPLC a contrapresión superior a 4000 psi.
  • Después de cada uso, limpie a fondo la columna con agua de grado HPLC y un disolvente adecuado.
  • Evite almacenar la columna con tampones, almacénela con los disolventes necesarios (metanol/acetonitrilo) y no deje que se seque.

Analista de Laboratorio

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