Cromatografía en capa fina - Definición, principio, partes, pasos, usos

Cromatografía es una importante técnica biofísica que permite la separación, identificación y purificación de los componentes de una mezcla para su análisis cualitativo y cuantitativo.

En este método físico de separación, los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria (fase estacionaria) mientras que la otra (la fase móvil) se mueve en una dirección definida. Según la fase estacionaria y la fase móvil elegidas, pueden ser de diferentes tipos.

¿Qué es la cromatografía en capa fina (TLC)?

La Cromatografía en Capa Fina puede definirse como un método de separación o identificación de una mezcla de componentes en componentes individuales mediante el uso de un sólido adsorbente finamente dividido / (líquido) extendido sobre una placa y un líquido como fase móvil.

Principio de la cromatografía en capa fina (TLC)

• La cromatografía en capa fina se realiza sobre una lámina de vidrio, plástico o papel de aluminio, que se recubre con una fina capa de material adsorbente, normalmente gel de sílice, óxido de aluminio (alúmina) o celulosa. Esta capa de adsorbente se conoce como fase estacionaria.
• Una vez aplicada la muestra en la placa, un disolvente o una mezcla de disolventes (conocida como fase móvil) asciende por la placa por acción capilar. Como los diferentes analitos ascienden por la placa de TLC a diferentes velocidades, se consigue la separación.
• Por tanto, se basa en el principio de la cromatografía de adsorción o de la cromatografía de partición, o en la combinación de ambas, según el adsorbente, su tratamiento y la naturaleza de los disolventes empleados. Los componentes con más afinidad hacia la fase estacionaria se desplazan más lentamente. Los componentes con menos afinidad hacia la fase estacionaria viajan más rápido.
• Una vez que se produce la separación, los componentes individuales se visualizan como manchas en un nivel respectivo de recorrido en la placa. Su naturaleza o carácter se identifica mediante técnicas de detección adecuadas.

Componentes de la Cromatografía de Capa Fina (TLC)

Los componentes del sistema de TLC consisten en

1. Placas de TLC, preferentemente preparadas con una fase estacionaria: Son placas estables y químicamente inertes, en las que se aplica una fina capa de fase estacionaria en toda su superficie. La fase estacionaria de las placas tiene un grosor uniforme y un tamaño de partícula fino.
2. Cámara de TLC- Se utiliza para el desarrollo de la placa de TLC. La cámara mantiene un ambiente uniforme en su interior para el correcto desarrollo de las manchas. También evita la evaporación de los disolventes y mantiene el proceso libre de polvo.
3. Fase móvil Está formada por un disolvente o una mezcla de disolventes La fase móvil utilizada debe estar libre de partículas y ser de la máxima pureza para el correcto desarrollo de las manchas de TLC. Los disolventes recomendados son químicamente inertes con la muestra, una fase estacionaria.
4. Un papel de filtro. Se humedece en la fase móvil, para colocarlo dentro de la cámara. Esto ayuda a desarrollar un ascenso uniforme en la fase móvil a lo largo de la fase estacionaria.

Procedimiento de la cromatografía en capa fina (TLC)

La fase estacionaria se aplica sobre la placa de manera uniforme y luego se deja secar y estabilizar. Sin embargo, hoy en día se utilizan más las placas ya preparadas.

1. Con un lápiz, se hace una fina marca en la parte inferior de la placa para aplicar las manchas de la muestra.
2. A continuación, se aplican las soluciones de las muestras sobre los puntos marcados en la línea en distancias iguales.
3. La fase móvil se vierte en la cámara de TLC hasta nivelar unos centímetros por encima del fondo de la cámara.
4. Se coloca un papel de filtro humedecido en fase móvil en la pared interior de la cámara para mantener una humedad igual (y también así se evita el efecto de borde).
5. Ahora, la placa preparada con la muestra manchada se coloca en la cámara de TLC de forma que el lado de la placa con la línea de la muestra esté orientado hacia la fase móvil. Luego se cierra la cámara con una tapa.
6. A continuación, se sumerge la placa, de forma que las manchas de la muestra queden muy por encima del nivel de la fase móvil (pero no sumergidas en el disolvente) para su desarrollo.
7. Se da el tiempo suficiente para el desarrollo de las manchas.
8. A continuación, se retiran las placas y se dejan secar.
9. A continuación, se observan las manchas de la muestra en una cámara de luz ultravioleta adecuada, o con cualquier otro método recomendado para la muestra en cuestión.

Algunas técnicas habituales para visualizar los resultados de una placa de TLC son

1. Luz UV
2. Tinción con yodo: es muy útil para detectar los hidratos de carbono, ya que se vuelve negro en contacto con el yodo
3. Tinción con KMnO4 (moléculas orgánicas)
4. Reactivo de ninhidrina: suele utilizarse para detectar aminoácidos y proteínas

Factor de retención (R_f ) Valor

• El comportamiento de un compuesto en una TLC suele describirse en términos de su movilidad relativa o valor Rf.
• El Rf o factor de retención es un valor único para cada compuesto en las mismas condiciones.
• El Rf de un compuesto es una constante de un experimento a otro sólo si las condiciones de cromatografía que le siguen son también constantes:
• sistema de disolventes
• adsorbente
• espesor del adsorbente
• cantidad de material manchado
• temperatura
• Como estos factores son difíciles de mantener constantes de un experimento a otro, generalmente se consideran los valores relativos de Rf.
• Rf relativo" significa que los valores se indican en relación con un estándar.
• El valor de Rf se calcula mediante la siguiente ecuación:

Aplicaciones de la cromatografía en capa fina (TLC)

1. Para controlar el progreso de las reacciones
2. Identificar los compuestos presentes en una mezcla determinada
3. Determinar la pureza de una sustancia.

• Analizar las ceramidas y los ácidos grasos
• Detección de pesticidas o insecticidas en los alimentos y el agua
• Análisis de la composición de los tintes de las fibras en el ámbito forense
• Análisis de la pureza radioquímica de los radiofármacos
• Identificación de plantas medicinales y sus componentes

Ventajas de la cromatografía en capa fina (TLC)

• Es un proceso sencillo con un tiempo de desarrollo corto.
• Ayuda a visualizar fácilmente las manchas de compuestos separados.
• Ayuda a aislar la mayoría de los compuestos.
• El proceso de separación es más rápido y la selectividad de los compuestos es mayor (incluso pequeñas diferencias químicas son suficientes para una separación clara).
• Los estándares de pureza de la muestra dada pueden evaluarse fácilmente.
• Es una técnica cromatográfica más barata.

Limitaciones de la cromatografía en capa fina (TLC)

• No puede diferenciar los enantiómeros y algunos isómeros.
• Para identificar compuestos específicos, hay que conocer de antemano los valores de Rf de los compuestos de interés.
• Las placas de TLC no tienen fases estacionarias largas. Por tanto, la duración de la separación es limitada en comparación con otras técnicas cromatográficas.

Referencias

1. https://owlcation.com/stem/tlc-thin-layer-chromatography-Principle-Procedure
2. https://www.utsc.utoronto.ca/webapps/chemistryonline/production/tlc.php
3. https://en.wikipedia.org/wiki/Thin-layer_chromatography
4. https://chem.libretexts.org/Demos%2C_Techniques%2C_and_Experiments/General_Lab_Techniques/Thin_Layer_Chromatography
5. https://www.slideshare.net/LavakusaBanavatu/thin-layer-chromatography-43293607