Cromatografía de permeación en gel - Definición, principio, partes, pasos, usos

La cromatografía de permeación en gel también se denomina filtración en gel o cromatografía de exclusión por tamaño.

En la cromatografía de exclusión por tamaño, la fase estacionaria es una matriz porosa formada por compuestos como poliestireno reticulado, dextranos cruzados, geles de poliacrilamida, geles de agarosa, etc.

La separación se basa en los tamaños moleculares del analito, ya que el gel se comporta como un tamiz molecular.

Esta técnica se utiliza para la separación de proteínas, polisacáridos, enzimas y polímeros sintéticos.

Como técnica, la cromatografía de exclusión por tamaño fue desarrollada por primera vez en 1955 por Lathe y Ruthven.

Principio de la cromatografía de permeación en gel

• Es una técnica en la que la separación de componentes se basa en la diferencia de peso o tamaño molecular.
• La fase estacionaria utilizada es una matriz polimérica porosa cuyos poros están completamente llenos del disolvente que se va a utilizar como fase móvil.
• Las moléculas de la muestra se bombean a través de columnas especializadas que contienen dicho material de relleno microporoso (gel).
• La base de la separación es que las moléculas que superan un determinado tamaño quedan totalmente excluidas de los poros, mientras que las moléculas más pequeñas acceden al interior de los poros parcial o totalmente.
• Por lo tanto, el flujo de la fase móvil hará que las moléculas más grandes pasen por la columna sin obstáculos, sin penetrar en la matriz del gel, mientras que las moléculas más pequeñas serán retardadas en función de su penetración en el gel.

Componentes/ Instrumentación de la Cromatografía de Permeación en Gel

1. Fase estacionaria
2. La fase móvil
3. Las columnas
4. La Bomba
5. Detectores

A. Fase estacionaria

Está compuesta por perlas de gel polimérico semipermeables y porosas, con una gama bien definida de tamaños de poros.

Tiene las siguientes propiedades:

• Químicamente inerte
• Mecánicamente estable
• Con una estructura porosa ideal y homogénea (un tamaño de poro amplio da una baja resolución).
• Un tamaño de partícula y de poro uniforme.

Ejemplos de gel:

1. Dextrano (Sephadex) gel: Un gel natural α 1-6-polímero de glucosa
2. Agarosa gel: Un gel natural de 1,3 enlaces de β-D-galactosa y 1,4 enlaces de 3,6-anhidro-α, L-galactosa
3. Acrilamida gel: Una acrilamida polimerizada, un gel sintético

B. La fase móvil

Se compone de un líquido que se utiliza para disolver las biomoléculas para que la fase móvil permita una alta respuesta de detección y humedezca la superficie del envase.

C. Columnas

Se puede utilizar cualquiera de los siguientes tipos:

• Columna analítica: diámetros de 7,5-8 mm.
• Columnas de preparación-22-25mm
• Longitudes de columna habituales-25, 30, 50 y 60 cm.
• Se han introducido columnas de calibre estrecho - 2-3 mm de diámetro

D. Bombas

Son bombas de jeringa o bombas de pistón con un gran caudal constante.

E. Detectores

Los detectores pueden ser sensibles a la concentración detectores, detectores de propiedades en masa, detectores de índice de refracción (RI)etc.

Pasos en Cromatografía de permeación en gel

Implica tres pasos principales:

A. Preparación de la columna para la filtración en gel

Implica:

1. Inflamación del gel
2. Embalaje de la columna Perlas de gel polimérico semipermeables y porosas con un rango bien definido de tamaños de poros.
3. Lavado: Tras el empaquetado, se hacen pasar por la columna varios volúmenes de solución tampón para eliminar las burbujas de aire y comprobar la homogeneidad de la columna.

B. Carga de la muestra en la columna mediante una jeringa

C. Eluir la muestra y detectar los componentes

Aplicaciones de la cromatografía de permeación en gel

1. Fraccionamiento de proteínas
2. Purificación
3. Determinación del peso molecular.
4. Separación de azúcares, proteínas, péptidos, gomas y otros en función de su tamaño.
5. Puede utilizarse para determinar la estructura cuaternaria de las proteínas purificadas.

Ventajas de la cromatografía de permeación en gel

• Tiempo de análisis corto.
• Separación bien definida.
• Bandas estrechas y buena sensibilidad.
• No hay pérdida de muestras.
• La pequeña cantidad de fase móvil requerida.
• Se puede ajustar el caudal.

Limitaciones de la cromatografía de permeación en gel

• El número limitado de picos que pueden resolverse dentro de la corta escala de tiempo de la ejecución de la GPC.
• Se deben realizar filtraciones antes de utilizar el instrumento para evitar que el polvo y otras partículas arruinen las columnas e interfieran con los detectores.
• Las masas moleculares de la mayoría de las cadenas estarán demasiado próximas para que la separación por GPC muestre algo más que picos amplios.

Referencias

1. Wilson, K., Walker, J. (2018). Principios y Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular (8 eds.). Cambridge University Press: Nueva York.
2. https://www.slideshare.net/asabuwangwa/gel-permeation-chromatography-gpc
3. http://www.materials-talks.com/blog/2016/08/30/an-introduction-to-gel-permeation-chromatography-in-30-minutes/
4. https://chromatography.conferenceseries.com/events-list/applications-of-chromatography
5. http://library.umac.mo/ebooks/b28050630.pdf
6. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5206469/