Prevención de anomalías en el tiempo de retención en el análisis HPLC

El tiempo de retención de un pico caracteriza la identidad del compuesto eluido. El tiempo de retención se explica en el artículo anterior ¿Cómo leo un cromatograma?. Es un parámetro de análisis esencial y las desviaciones resultantes de cambios involuntarios o no controlados en las condiciones operativas pueden resultar molestas para el cromatógrafo. Es de suma importancia mantener bien controladas las condiciones de funcionamiento para evitar tales desviaciones.

Desviación del tiempo de retención
Desviación del tiempo de retención

Las desviaciones del tiempo de retención se deben principalmente a:

  • Cambios en la composición de la fase móvil
  • Cambio de temperatura de la columna.
  • Cambio en grupos de superficie de fase estacionaria
  • Variables de columna a columna
  • Cambios en el caudal de la fase móvil.

Comprender las razones responsables de la desviación del tiempo de retención le ayudará a apreciar mejor los controles.

Cambio en la composición de la fase móvil

A medida que avanza la fase móvil premezclada, algunos componentes orgánicos volátiles pueden evaporarse, lo que provoca variaciones en la composición. Tales pérdidas también pueden ocurrir si las botellas de solvente no están selladas. Otro motivo de las pérdidas es la filtración al vacío de disolventes premezclados y la desgasificación mediante baños ultrasónicos que aumentan la temperatura de la fase móvil durante la sonicación. Las variaciones en la concentración de la fase móvil premezclada pueden evitarse utilizando fases móviles recién preparadas, desgasificando en línea y manteniendo las botellas tapadas durante el uso.

Cambios en la temperatura de la columna

Los cambios de temperatura afectan tanto la viscosidad de la fase móvil como los mecanismos de retención de la fase estacionaria. Los compuestos ionizables tienden a ser más atacados que los compuestos no ionizables. Mediante el uso de hornos de columna que mantienen la temperatura de la columna, se pueden reducir tales desviaciones

Cambios en grupos de superficie de fase estacionaria

Los grupos de superficie tienden a verse afectados por cambios en las concentraciones de tampón. Las concentraciones de tampón muy bajas no pueden mantener el pH requerido. Las concentraciones de tampón superiores a 0,1 M aumentan la viscosidad, lo que puede provocar problemas de contrapresión. Si se utilizan medios con un pH inferior a 2, la fase estacionaria se puede despojar de los grupos funcionales orgánicos.

Variabilidad columna a columna

El historial de uso de columnas puede generar desviaciones medibles en los tiempos de retención. Los tiempos de retención pueden no coincidir con los de la columna en la que se desarrolló el método. Los cambios debidos al volumen de residencia de dichas columnas pueden compensarse extendiendo el equilibrio de la corrida isocrática antes de comenzar el análisis principal.

Cambios de caudal

Los cambios en el caudal conducen naturalmente a una desviación en los tiempos de residencia. Tasas más bajas conducen a tiempos de retención más prolongados para los mismos picos. La consistencia del caudal se puede mantener mediante:

  • Mantenga la temperatura de la columna mediante el uso de un horno de columna
  • Verifique que no haya fugas alrededor de las conexiones de las mangueras, las válvulas de inyección e inspeccione periódicamente los sellos del pistón para detectar daños.
  • Inspección periódica de válvulas de retención. La formación de recubrimientos superficiales en las bolas puede provocar una reducción del flujo. Limpie o reemplace dichas bolas.
  • Las fluctuaciones en la contrapresión debidas a las burbujas de aire atrapadas se pueden eliminar lavando el sistema.

Se puede concluir que el tiempo de retención y las derivas son causados ​​por cambios en el caudal de la fase móvil, cambios en la fase móvil o fase estacionaria y la temperatura de la columna. Le invitamos a compartir sus experiencias y dejar sus valiosos comentarios.

Analista de Laboratorio

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