Cómo la microscopía óptica resolvió un problema común de laboratorio

Los investigadores estudian rutinariamente el comportamiento de las moléculas biológicas, especialmente las proteínas, bajo un microscopio, con la esperanza de identificar la función de una proteína en particular. En un esfuerzo por facilitar la detección de una proteína, los investigadores a menudo agregan una etiqueta molecular. Lejos de las etiquetas de papel tradicionales, la mayoría de la gente imagina etiquetas moleculares que utilizan un tinte o enlaces covalentes para unir una molécula de enzima fluorescente, radiactiva o informadora a la proteína objetivo.

Comprender las ventajas y desventajas de las imágenes marcadas puede revelar por qué métodos como la microscopía son excelentes para caracterización de proteínas y rastrear el movimiento de proteínas dentro de una célula viva.

Desventajas de las imágenes etiquetadas

Si bien estos marcadores hacen que el seguimiento de una proteína objetivo sea mucho más fácil para los investigadores, también existen inconvenientes. Algunos tintes y sustancias fluorescentes interfieren con la función celular normal, lo que puede hacer que el estudio del comportamiento de las proteínas sea irrelevante. Otros producen demasiada fluorescencia, lo que dificulta distinguir entre la proteína y otras partes de la célula, o incluso pueden estar sujetos a fotoblanqueo por la luz ambiental.

Como resultado, los investigadores han desarrollado formas de estudiar la estructura de los tejidos, el comportamiento de las proteínas y otros fenómenos sin necesidad de agregar etiquetas fluorescentes o colorantes a las muestras de laboratorio. Estas técnicas de imagen sin etiquetas eliminan los efectos negativos que tiene un etiquetado más intrusivo en la muestra misma y en la imagen generada. Principalmente, estas técnicas se basan en el uso de microscopía óptica.

microscopia óptica

El uso de microscopía óptica para estudiar el comportamiento de células y proteínas no es nuevo. Sin embargo, los avances en los láseres utilizados para producir imágenes del material estudiado han llevado a un aumento drástico en la calidad de las imágenes entregadas. Además, la formación de imágenes no es invasiva y tiene poco efecto sobre los materiales celulares estudiados.

Este logro requirió principalmente el uso de microscopía de fluorescencia de dos fotones, una tecnología que utiliza un láser ultrarrápido y preciso para proporcionar un contraste entre las proteínas u otras partes de la célula. Este láser generalmente opera a nivel infrarrojo y emite dos o más fotones muy rápidamente para excitar los compuestos fluoróforos. En respuesta, estos compuestos liberan un fotón, que emite luz en el espectro visible.

Elegir la técnica adecuada

Al igual que con cualquier procedimiento de emisión de luz, la dispersión, la reabsorción y reemisión de la luz producida por otros compuestos circundantes, ocurrirá inevitablemente. Algunos métodos sin etiquetas, como la tomografía de coherencia óptica, utilizan esta dispersión para reconstruir la imagen producida a partir del patrón de dispersión. Otros métodos, como la microscopía de segunda generación armónica (SHG) y la microscopía de tercera generación armónica (THG), involucran un proceso de dispersión de luz no lineal, mientras que la microscopía infrarroja hace que vibren los enlaces altamente químicos en una molécula.

Otra técnica interesante es la microscopía de dispersión interferométrica, que funciona recolectando la luz dispersada junto con un campo de luz de referencia. Los investigadores miden la interferencia causada por la dispersión de la luz con una referencia de láser, lo que permite obtener imágenes de proteínas de hasta 50 kilodaltons.

Dependiendo del objetivo de la investigación, se puede preferir una técnica sobre la otra. Por ejemplo, THG es bastante versátil, pero no se puede utilizar de forma extensiva en muestras vivas porque la radiación ionizante puede dañar las células de forma irreversible. También es importante que los laboratorios elijan la longitud de onda adecuada para el trabajo, ya que ciertas longitudes de onda minimizan el daño de las fotografías y son las preferidas para las imágenes de lapso de tiempo.

Progreso Continuo

Muchos laboratorios combinan el uso de dos, tres o más de estas técnicas, según los resultados que quieran lograr. A medida que continúa la investigación y el desarrollo en microscopía óptica, los científicos esperan refinar las técnicas multimodales para dar a los laboratorios la capacidad de utilizar los mejores aspectos de cada técnica en conjunto y sin interferencias entre sí. El progreso continuo en estos esfuerzos podría conducir a una forma mínimamente invasiva, no disruptiva y sin etiquetas para extraer la mayor cantidad de información de una muestra determinada.

fuentes:

https://www.nature.com/articles/s41592-019-0664-8

https://en.wikipedia.org/wiki/Interferometric_scattering_microscopy

https://www.toptica.com/applications/optical-microscopy/multiphoton-microscopy/

https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-protein- etiquetado.html

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3104727/

https://jcs.biologists.org/content/129/2/245