Principio y procedimiento de la cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad es una forma de cromatografía líquida que se utiliza para aislar y purificar analitos de forma específica. Utiliza una interacción biológica reversible llamada afinidad que hace referencia a la atracción forzada utilizada entre los átomos en distintos grados que hacen que se mantengan en combinación.

La cromatografía de afinidad es uno de los métodos cromatográficos más versátiles y eficaces para separar una mezcla compleja de un solo grupo de componentes. Se basa en interacciones biológicas muy precisas entre dos componentes, tales como interacciones enzima-sustrato, anticuerpos y antígenos, o receptor y ligando. Estas interacciones típicamente reversibles se utilizan para la purificación, en la que las moléculas conocidas como molécula se colocan sobre una matriz sólida para formar una fase estacionaria mientras los componentes se encuentran en la fase móvil. Muchos de los ligandos ampliamente utilizados están asociados con matrices que ahora están disponibles comercialmente y listas para utilizar.

Tabla de contenidos ¿Qué es la cromatografía de afinidad? Principio de la cromatografía de afinidad Procedimiento de cromatografía de afinidad Aplicaciones cromatografía de afinidad Ventajas de la cromatografía de afinidad Inconvenientes de la cromatografía de afinidad

 

La fase estacionaria consiste en un medio de apoyo al que se une simpáticamente el sustrato, para revelar la necesaria unión de los grupos reactivos de la molécula diana. A medida que la muestra sucia de la mezcla de moléculas se recorre por la columna, en la fase estacionaria, las moléculas con un lugar de unión a la fase estacionaria se unen mientras que todas las demás sustancias se eluyen en el volumen vacío de la columna cromatográfica. Una vez eluidas otras moléculas de la columna, las moléculas diana ligadas se pueden superar mediante la inclusión de un ligando competidor en la fase móvil, o cambiando el pH, la fuerza iónica o el estado de polaridad.

Antes de empezar un experimento de cromatografía de afinidad, debemos reconocer los distintos componentes esenciales para llevar a cabo el proceso.

Matriz: Es un soporte pasivo que se puede unir directa o indirectamente a un ligando.

Brazo separador: Al eliminar cualquier efecto de obstáculo satírico, se utiliza para mejorar la unión entre el ligando y la molécula diana.

Ligando: Se refiere a un componente que se une opuesto a una concreta molécula objetivo.

1. Lavar la columna y la fase estacionaria con la solución tampón para preparar el ligando para la unión.

2. Rellene la columna con soportes sólidos como agarosa, safarosa y celulosa, etc.

3. Seleccione el ligando según la separación deseada.

4. Pegue el brazo separador entre el ligando y el soporte sólido.

1. Vierta una mezcla de muestra en una columna y déjela funcionar a una velocidad controlada.

Elución de ligando-molécula:

2. El componente deseado se recupera ajustando las condiciones favorables para que las moléculas ligadas se adhieran.

• Para toda separación y purificación de macromoléculas biológicas se utiliza la cromatografía de afinidad.
• Se utiliza para purificar anticuerpos, ácidos nucleicos y enzimas.
• También se utiliza para disminuir la cantidad de una substancia en una mezcla compleja.
• La cromatografía de afinidad se utiliza para observar qué compuestos biológicos se unen a una determinada sustancia.
• La cromatografía de afinidad se utiliza en aplicaciones clínicas.
• Otra aplicación de la cromatografía de afinidad en química analítica es una herramienta para el estudio de la cinética de la interacción biológica.

• Las moléculas diana pueden obtenerse por cromatografía de afinidad en estado altamente purificado.
• Puede utilizarse para extraer contaminantes particulares.
• La cromatografía de afinidad tiene una mayor sensibilidad que la FID y la FCD.
• La cromatografía de afinidad se utiliza en la producción de vacunas.
• La cromatografía de afinidad proporciona un alto grado de pureza.
• Se utiliza en la producción de vacunas en la fabricación farmacéutica para mejorar la calidad del producto.
• No depende de la temperatura, composición del tampón, pH y fuerza iónica.
• Mejorar la solubilidad de la cromatografía de afinidad utilizada.

• Se necesita mucha habilidad para ello.
• Esto no es específico para la adsorción en comparación con otras técnicas de cromatografía.
• Los ligandos utilizados en esta cromatografía son caros.
• A veces se producen fugas de ligandos en la cromatografía de afinidad.
• La transferencia y el escape de iones metálicos conducen a la pérdida de proteínas.

La cromatografía de afinidad es una técnica de separación y análisis de biomoléculas en función de sus estructuras o funciones biológicas. Es un método de separación importante y útil en bioquímica, biotecnología, ciencia ambiental y ciencia farmacéutica.

El principio básico de la cromatografía de afinidad es que un ligando bioespecífico se inmoviliza en una fase estacionaria o resina de la matriz de la columna, como la agarosa o la celulosa.

La cromatografía de afinidad es un tipo de cromatografía líquida que se utiliza para la purificación de biomoléculas específicas, incluidas las proteínas.

La principal ventaja de la cromatografía de afinidad es que puede conseguir una especificidad muy alta y un alto grado de pureza.

La principal diferencia entre la cromatografía de afinidad y la de intercambio iónico es que la cromatografía de afinidad se utiliza para separar moléculas cargadas o no cargadas, mientras que la cromatografía de intercambio iónico se utiliza para separar moléculas cargadas.