Selección del tampón en el desarrollo del método HPLC

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Selección del tampón en el desarrollo del método HPLC

La elección del tampón para el desarrollo del método HPLC es importante, ya que puede afectar al aislamiento del HPLC. Es significativo que el buffer tenga en pKa cerrar al pH preferido, ya que los tampones controlan mejor el pH en su pKa.
 
Realizar una fase móvil acuosa es la etapa más importante del desarrollo del método RP-HPLC para moléculas iónicas. Contiene una consideración de los efectos del pH sobre el tiempo de retención de un componente, la concentración y el tipo de tampón, la solubilidad y su efecto en la detección. La selección inadecuada del tampón, en términos de pH, fuerza iónica y especies amortiguadoras, puede dar lugar a un tiempo de retención irreductible de los compuestos polares e ionizantes en la separación en fase inversa.
Las complejidades como las interacciones entre moléculas y la ionización parcial, las moléculas y otros lugares activos en fases estacionarias pueden conquistarse seleccionando el tampón adecuado su correcta especie iónica y la fuerza iónica en la fase móvil. En separaciones LC-MS que dependen demasiado de la elección correcta del ácido, la base, las especies tampones y otros aditivos, debe seleccionarse un tampón en función de su capacidad para suprimir y no inhibir la ionización de la molécula en la interfaz MS. El tiempo de retención de los componentes iónicos en la cromatografía de fase inversa está influenciado fundamentalmente por el pH de la fase móvil. La RT de los componentes no iónicos se ve mínimamente afectada por el pH de la fase móvil.

El tampón es una solución de una base débil y su ácido conjugado o ácido débil y su base conjugada. Reducen el efecto de los iones hidróxido e hidrógeno y reducen las fluctuaciones de pH en la dilución. Normalmente, el rango de pH es de 2,00 a 8,00 para RP-HPLC en embalajes a base de sílice. La selección de una solución tampón normalmente se rige por el pH preferido. Si el pKa se aproxima al pH, los tampones controlan mejor el pH. Los sistemas tampón más utilizados para la cromatografía en fase inversa son el ácido fosfórico y sus sales de potasio o sodio, tampones de acetato, que también se utilizan frecuentemente para la separación.

El tampón de fosfato es ideal para la mayoría de separaciones HPLC, puesto que tiene dos valores de pKa, (2,1 y 7,1) y transparencia UV. Pero el uso de tampón fosfato en LC-MS no es adecuado, prefiere sistemas tampón volátiles, es decir, acetato, TFA, amoníaco y formiado, etc.

 

Concentración de tampón:

Cuanto mayor sea la concentración del tampón que aumenta la capacidad del tampón, dará una separación más reproducible de los analitos parcialmente ionizados en el pH de la fase móvil, normalmente, una concentración de tampón de 10 a 50 mM es suficiente para la separación de componentes . Un buffer altamente concentrado provocará un retroceso elevado para el sistema.

 

pH del tampón:

El tiempo de retención de los componentes iónicos en la cromatografía de fase inversa se ve básicamente afectado por el pH de la fase móvil en comparación con los componentes no iónicos. Por lo general, el rango de pH de la solución tampón o la fase móvil para RP-HPLC es de 2,00 a 8,00. La selección de soluciones tampón se controla normalmente por el pH preferido.

 

Efectos en la detección:

La selección del buffer depende también de los medios de detección. Para el detector UV/VIS convencional, la solución tampón debe ser transparente, efectivamente en ese rango, especialmente importante para la separación de elución del gradiente.

 

Solubilidad del tampón:

Esto es especialmente significativo cuando se trabaja con el método de elución de gradiente. La solubilidad puede determinarse empíricamente mezclando las fracciones de volumen especificadas del disolvente orgánico y la solución tampón. La presencia de soluciones de precipitados especifica que los problemas de solubilidad con el soluto y la fase móvil o disolvente. Una norma general es que la fase orgánica no debe superar el 50%, que debe utilizarse con el tampón.

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Analista de Laboratorio

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