En cromatografía líquida de alto rendimiento, para separar los componentes es nuestro objeto y esto ocurre en la columna (fase estacionaria), por tanto, la columna es el corazón del sistema HPLC. Cambiar las columnas HPLC durante el desarrollo del método tendrá el mayor impacto en la resolución de los analitos. Normalmente, las columnas de cromatografía de fase inversa actuales se hacen empaquetándose con perlas de hielo de sílice globulares que están recubiertas con la fase estacionaria hidrófoba. Normalmente, la naturaleza de la fase estacionaria tiene mayor influencia en la elución, el factor de capacidad, la selectividad y la eficiencia. Hay varios tipos de matrices para el soporte de fase estacionaria, incluyendo polímeros, sílice y alúmina.
La sílice es la matriz más habitual para columnas HPLC. La sílice es químicamente estable para los sistemas de pH bajo y la mayoría de disolventes orgánicos. El inconveniente del soporte sólido de sílice es que se disuelve por encima de pH 7. Actualmente, las columnas de HPLC se desarrollan para utilizarlas en un rango de pH alto. El tamaño de las partículas, la naturaleza y la forma de la sílice afectan a la separación de los analitos.
El uso de pequeñas partículas de sílice aumenta la eficiencia de separación o aumenta el número de placas teóricas. Sin embargo, el uso de pequeñas partículas aumenta la contrapresión del sistema y la columna se obtura más fácilmente. La fase móvil en RP-HPLC es polar y la fase estacionaria es no polar, por lo que las moléculas polares suelen eluir antes que las moléculas no polares.
Para formar una fase estacionaria para RP-HPLC sobre soportes de sílice, para introducir una superficie no polar se hacen reaccionar silanoles libres con un clorosilano con funcionalidad hidrófoba. Debido a las barreras estáticas, sólo aproximadamente 1/3 de los silanoles están derivados. Los silanoles restantes pueden interactuar con las moléculas, dando lugar a un pico de cola.
Normalmente, tras la derivatización de la columna con la fase estacionaria preferida, el clorotrimetilsilano reacciona con la columna STEM para eliminar los restantes silanoles libres y mejora la eficiencia de la columna. Las columnas C18 (octadecil), C4 (butilo), Cs (octil), fenil (fenilo propilo) y nitrilo (cianopropilo) son fases estacionarias que se utilizan habitualmente. En común, las cargas de carbono más altas, las cargas de fase más altas y las cadenas alquiles más largas dan una mejor retención de los componentes no polares.
A continuación se enumeran algunas fases unidas comunes para columnas HPLC.
SI, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C8, C18, CN, NH2, NO2, OH, FENIL, SCX, SAX, WCX, CERA.
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