Máquina PCR - Principio, partes, pasos, tipos, usos, ejemplos

La máquina de PCR también se conoce como termocicladores o amplificadores de ADN, o termocicladores. Las máquinas de PCR amplifican pequeños segmentos de ADN o ARN seleccionados del genoma con un cebador. Es una herramienta barata y muy eficaz.

Funciona con los conceptos de hibridación de ácidos nucleicos complementarios y replicación de ácidos nucleicos para fabricar exponencialmente secuencias específicas de ADN/ARN objetivo por un factor de 10^7 en pocas horas.

Las máquinas de PCR se utilizan en los laboratorios de investigación y en los diagnósticos clínicos para replicar el ADN, detectar secuencias de ADN, realizar huellas de ADN, análisis forenses y clonación molecular, diagnosticar enfermedades genéticas y detectar agentes patógenos como los virus de la hepatitis B y C, y el VIH-1 causante del SIDA, Chlamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis, El virus del papiloma humano, y el Citomegalovirus. Esto acelera otros procesos sensibles a la temperatura, como la digestión con enzimas de restricción o el diagnóstico rápido. Amplifican segmentos de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

La PCR, a veces llamada "fotocopia molecular", es frecuentemente aclamada como uno de los avances científicos más importantes de la biología molecular. Ha revolucionado el estudio del ADN hasta el punto de que su inventor, Kary B. Mullis, recibió el Premio Nobel de Química en 1993. Sin la amplificación por PCR, los exámenes de fragmentos individuales de ADN son casi imposibles, ya que se necesitan grandes volúmenes de muestras de ADN para los análisis moleculares y genéticos.

Principio de la PCR

Un molde de ADN monocatenario se utiliza como andamio para la enzima ADN polimerasa, que guía la síntesis de ADN a partir de sustratos desoxinucleótidos. Cuando un oligonucleótido especialmente creado se anuda a un ADN molde más largo. La ADN polimerasa añade nucleótidos al extremo 3′ de la molécula. Así, la ADN polimerasa puede emplear un oligonucleótido sintético como cebador y extender su extremo 3′ para crear un tramo extendido de ADN de doble cadena cuando se recoja en una plantilla de cadena simple con una región complementaria al oligonucleótido.

Partes de una máquina de PCR

• El termociclador tiene un bloque térmico con agujeros en los que se pueden introducir los tubos que contienen las mezclas de reacción.
• Se suministra con una tapa calentada que se presiona contra las tapas de los tubos de reacción. La tapa evita la condensación del agua de las mezclas de reacción en el interior de las tapas.
• Al girar el pomo de la tapa en el sentido de las agujas del reloj, se baja la placa calefactora, lo que presiona el tapón del tubo para que se asiente firmemente en el bloque y garantiza un mejor contacto. A la inversa, si se gira en sentido contrario a las agujas del reloj, se levanta la tapa para que los usuarios puedan deslizarla hacia atrás.
• El panel de control incluye una pantalla gráfica grande y fácil de leer que muestra el estado actual de varias características y funciones del sistema, así como un teclado que se utiliza para introducir varios protocolos y parámetros.
• La presencia de respiraderos en la parte delantera, lateral e inferior facilitan la entrada y salida de aire.

Componentes de la PCR (reactivos de la PCR)

Plantilla de ADN

• Es fundamental elegir las plantillas adecuadas para la PCR.
• Se necesitan plantillas de ARN para crear ADN complementario en la RT-qPCR, mientras que para la PCR tradicional se necesitan plantillas de ADN.
• Por lo tanto, el primer paso para el éxito de la PCR requiere el uso de un kit de preparación de plantillas de PCR fiable.

Polimerasa de ADN termoestable

• Como el paso inicial de la PCR requiere la separación de las cadenas de ADN a una temperatura elevada (90°C), todas las reacciones de PCR requieren una ADN polimerasa que pueda funcionar a una temperatura elevada (aproximadamente 70°C).
• Una popular polimerasa de ADN para la PCR conocida como Taq polimerasa, obtenida de la bacteria termófila Thermus aquaticus es una enzima estable al calor.

Cebadores oligonucleótidos

• Los cebadores son cadenas cortas de nucleótidos (ADN o ARN) que son complementarias al ADN molde y sirven como punto de partida para que la ADN/ARN polimerasa comience a sintetizar nuevo ADN.
• Los cebadores son cadenas cortas de nucleótidos (ADN o ARN) que son complementarias al ADN molde y sirven como punto de partida para que la ADN/ARN polimerasa comience a sintetizar ADN. Son necesarios para el inicio de la síntesis del ADN. Para el recocido de los cebadores en el ADN monocatenario se necesitan temperaturas más bajas (50-65°C) que para la desnaturalización, que genera enlaces de hidrógeno una vez finalizado el proceso de recocido.

Trifosfato de desoxirribonucleótidos (dNTPs)

• Los dNTPs son necesarios para que la ADN polimerasa sintetice el ADN.

Sistema de amortiguación

• Siempre se mantienen las mejores condiciones para la reacción de PCR mediante el uso de tampones de PCR.
• Tris-HCl, cloruro de potasio (KCl) y cloruro de magnesio (MgCl)₂) constituyen la mayor parte de los ingredientes del tampón de PCR.
• Para mantener el pH estable durante la PCR, se utilizan tris-HCl y KCl. Para que la ADN polimerasa realice correctamente la síntesis de ADN durante la PCR, los iones de magnesio sirven de cofactores para la enzima.

Pasos de la PCR

Desnaturalización

• Cuando la mezcla de reacción se calienta de 0,5 a 2 minutos a 94°C, se produce la desnaturalización.
• Al romperse los enlaces de hidrógeno entre las dos cadenas de ADN, se crea un ADN monocatenario.
• Las hebras simples de ADN sirven ahora como plantilla para la síntesis de otras hebras de ADN.

Recalentamiento

• Durante unos 20-40 segundos, la temperatura de reacción se reduce a 54-60 °C.
• Los cebadores se unen a las secuencias complementarias del ADN molde en esta circunstancia.
• Las secuencias de cebadores son segmentos de ADN o ARN monocatenario de 20 a 30 bases.
• Actúan como precursores en la producción de ADN.
• Hay dos cebadores -un cebador directo y un cebador inverso- las dos hebras separadas van en direcciones opuestas.

Alargamiento

• En esta fase se aumenta la temperatura a entre 72 y 80 grados centígrados.
• La enzima Taq polimerasa grapa las bases en el extremo 3′ del cebador. Como resultado, el ADN se estira de 5′ a 3′.
• La Taq polimerasa puede soportar temperaturas extremadamente altas. Como resultado se produce una molécula de ADN de doble cadena.

Para obtener varias secuencias de ADN de interés en poco tiempo, estos tres procedimientos se realizan de 20 a 40 veces.

Instrucciones de uso de la máquina PCR

• Inicialmente, la muestra se calienta con una máquina de PCR que hace que el ADN se desnaturalice y se separe en dos trozos de ADN monocatenario.
• A continuación, una enzima llamada "Taq polimerasa" crea o construye dos nuevas cadenas de ADN utilizando las antiguas cadenas como plantillas.
• Mediante este procedimiento, el ADN original se duplica, con una hebra antigua y otra nueva de ADN presentes en cada nueva molécula.
• Luego, cada uno de estos hilos puede utilizarse para hacer dos copias más, y así sucesivamente.
• Hay más de mil millones de réplicas exactas del segmento de ADN original cuando el ciclo de desnaturalización y creación de nuevo ADN se repite hasta 30 o 40 veces.
• Todo el procedimiento de ciclado de la PCR está automatizado y puede completarse en pocas horas. La reacción se controla mediante un dispositivo llamado termociclador, que está configurado para cambiar la temperatura de la reacción cada pocos minutos para permitir la desnaturalización y la síntesis del ADN.

PCR en tiempo realtambién conocido como PCR cuantitativa o qPCRes una técnica para controlar y cuantificar los resultados de la PCR en tiempo real marcando las moléculas de ADN con un colorante fluorescente.

Transcriptasa inversa (RT-PCR) convierte el ARN en ADN en el proceso de producción de ADN complementario (ADNc).

PCR anidada reduce la posibilidad de productos no deseados realizando una segunda PCR con nuevos cebadores "anidados" dentro de los 25-35 ciclos de PCR iniciales.

PCR de arranque en caliente utiliza el calor para desnaturalizar los anticuerpos que se utilizan para inactivar la Taq polimerasa.

PCR múltiplex multiplica varios fragmentos en una sola muestra de ADN utilizando varios cebadores.

PCR de largo alcance utiliza una variedad de polimerasas, para generar mayores rangos de ADN.

PCR in situ es un tipo de PCR que se produce en células o tejidos fijados en un portaobjetos.

Una hebra del ADN objetivo se amplifica mediante una PCR asimétrica proceso.

Uso de cebadores superpuestos en Montaje de la PCR permite la amplificación de fragmentos de ADN más largos.

Aplicaciones de la PCR

1. Transcripción de genes

• La PCR puede estudiar las diferencias en la transcripción de genes entre distintos tipos de células, tejidos y especies en un momento dado.
• La transcripción inversa se utiliza para crear ADNc aislando el ARN de las muestras de interés.
• La cantidad de ADNc producida por la PCR puede utilizarse entonces para calcular los niveles originales de ARN de un gen concreto.

2. Genotipado

• Se pueden determinar las diferencias de secuencia en los alelos de ciertas células u organismos.
• El genotipado de los organismos transgénicos facilita la amplificación de la mutación o de una parte transgénica.

3. Clonación y mutagénesis

• La clonación por PCR permite la obtención de nuevas cepas de bacterias con material genético alterado mediante la inserción de fragmentos amplificados de ADNc en vectores como el ADNg, el ADNc y el ADN plasmídico.
• La clonación permite la introducción de mutaciones puntuales mediante la mutagénesis dirigida al sitio, que a su vez utiliza el método de la PCR recombinante.
• También permite la creación de nuevas fusiones de genes.

4. Secuenciación

• La secuenciación va acompañada de la amplificación del ADN molde, su purificación y el procesamiento mediante una etapa de secuenciación.
• La PCR también se utiliza en la secuenciación de nueva generación (NGS) durante la fase de preparación de la biblioteca para cuantificar las muestras de ADN y etiquetarlas con adaptadores de secuenciación para la multiplexación.

5. Medicina e Investigación Biomédica

• Las aplicaciones médicas incluyen los cambios genéticos relacionados con las enfermedades y la identificación de organismos infecciosos. Las pruebas genéticas prenatales utilizan la PCR para detectar anomalías cromosómicas y mutaciones genéticas durante el embarazo, proporcionando a los futuros padres información crucial sobre la probabilidad de que sus hijos padezcan una determinada enfermedad genética.
• También puede utilizarse como técnica de diagnóstico genético preimplantacional para seleccionar embriones para la fecundación in vitro (FIV).

6. Ciencia forense

• La PCR puede ser útil en las investigaciones forenses para identificar las fuentes de las muestras y las pruebas de paternidad.
• Se utiliza en arqueología molecular para amplificar el ADN de los artefactos.

7. Microbiología ambiental y seguridad alimentaria

• Los patógenos pueden encontrarse mediante la PCR, no sólo en muestras de pacientes, sino también en matrices como los alimentos y el agua. Esto es importante tanto para el diagnóstico como para la prevención de enfermedades infecciosas.

Beneficios de la PCR

• Permite una toma de decisiones más rápida e informada
• Identificación rápida de la bacteriemia, especialmente en el caso de las muestras de bajo recuento
• Es eficaz para identificar casos en muestras extrapulmonares que el frotis y/o el cultivo pueden haber pasado por alto.
• Importante para identificar ciertas enfermedades que son difíciles o que requieren mucho tiempo de cultivo in vitro. Produce resultados mucho más rápidamente que el cultivo.
• Se sigue considerando una prueba auxiliar para algunos procedimientos de diagnóstico que dependen del frotis y el cultivo, como la tuberculosis.
• Tiene la capacidad de analizar la resistencia a los antimicrobianos.

Limitaciones de la PCR

• La amplificación de objetivos desconocidos no es posible con la PCR. El diseño de los cebadores requiere un conocimiento previo de la secuencia objetivo.
• Las polimerasas de ADN propensas a errores pueden dar lugar a mutaciones en el producto de la PCR.
• La PCR es extremadamente sensible a la contaminación. Los resultados pueden ser malinterpretados o engañosos si hay incluso una pequeña cantidad de ADN contaminado.
• A medida que aumenta el tamaño del amplicón, disminuye la eficacia de la PCR.

Precauciones a tomar con la máquina PCR

• Sólo deben utilizarse los tubos y placas diseñados para la máquina de PCR.
• Antes de empezar, comprueba que los tubos y, sobre todo, las placas están bien cerrados.
• Los derrames de la solución deben limpiarse y utilizar contenedores de riesgo biológico para su eliminación.
• Ten cuidado cuando utilices la cubierta de la máquina PCR. Si se te caen o golpean las cubiertas, pueden romperse.
• Cuando hayas terminado de utilizar la máquina PCR, apágala.
• Antes de iniciar un recorrido, asegúrate de que el bloque de calentamiento de la PCR está limpio. Antes de empezar, inspecciona cada soporte de tubo.
• Para que la tapa quede plana contra la parte superior de los tubos para que se calienten y sellen de manera uniforme, reparte los tubérculos uniformemente sobre el bloque.

Ejemplos de máquinas de PCR

Termociclador Biometra Serie TAdvanced (Analytik Jena)

• Doce bloques de muestras independientes, incluido un bloque de plata de 96 pocillos de alta gama
• Con la potente electrónica de control actual, incluso un bloque de aluminio puede producir un calentamiento y un enfriamiento más rápidos de lo que suele ser posible con los instrumentos de bloque de plata únicamente.
• La rampa más rápida, la mayor precisión y el control inteligente de bloque/pozo (RAC) proporcionan la mayor uniformidad y reproducibilidad de la temperatura, sin sobrepasar ni subestimar la temperatura objetivo programada.
• El calentamiento rápido, la presión de contacto continua y la facilidad de uso son características de la tecnología High-Performance Smart Lid (HPSL).

Ciclador térmico MiniAmp™ Plus (ThermoFisher Scientific)

• Los bloques VeriFlex tienen tres zonas de temperatura distintas que te permiten gestionar con precisión la temperatura para la optimización de tu PCR.
• Pantalla táctil intuitiva en color de 5" - Fácil de programar y enseñar a los nuevos usuarios Tamaño compacto - Con un tamaño de sólo 19 cm de ancho y 39 cm de profundidad, el termociclador MiniAmp cabe en casi cualquier lugar. Las capacidades de Thermo Fisher Connect WiFi te permiten diseñar y descargar tus métodos de forma segura desde cualquier dispositivo móvil u ordenador de sobremesa.
• Además, como su flujo de aire es de adelante hacia atrás, puedes colocar varias unidades una al lado de la otra para ahorrar un valioso espacio en el banco.

Termocicladores PCR (Esco)

• Para todo tipo de procesos de PCR, como la PCR de gradiente, la PCR de contacto, la PCR de alto rendimiento, la PCR in situ y otras que utilizan una serie de tubos, tiras, placas y portaobjetos para PCR,
• Esco ofrece una selección de modelos de termocicladores convencionales y en tiempo real que están construidos para cumplir requisitos estrictos.
• Para establecer y mantener un control preciso y unas velocidades de rampa rápidas, con poco rebasamiento o rezago, para la velocidad y la precisión del proceso, los termocicladores Swift utilizan la tecnología más avanzada de control de temperatura Peltier.

SERIE GET-S TERMOCÍMICA (Bio-gener)

• En el termociclador de la serie GET-S se utiliza un peltier de larga duración. Su velocidad de rampa máxima es de 4,5 °C/s, y sus tiempos de ciclo superan el millón.
• El producto incorpora una serie de tecnologías avanzadas, como el sistema operativo Android, una pantalla táctil capacitiva en color, múltiples opciones de bloqueo, un módulo WIFI integrado, funcionalidad de control mediante software para PC, funcionalidad de notificación por correo electrónico, gran capacidad de almacenamiento, etc.
• Estas características permiten que la PCR sea muy eficaz y cumpla con los requisitos experimentales más exigentes.

Termociclador MiniAmp Plus y Termociclador MiniAmp (Delta Science)

• Cabe en cualquier banco gracias a su pequeño tamaño.
• Con Thermo Fisher Connect, puedes acceder fácilmente a tu instrumento desde cualquier lugar con acceso a Internet.
• Cuando te actualizas al termociclador MiniAmpTM Plus de Applied Biosystems, tienes la opción de obtener la tecnología de control de temperatura VeriFlexTM para optimizar la PCR.

Referencias

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9. http://escolifesciences.co.th/product-categories/118/
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13. https://www.deltasciencemm.com/miniamp-plus-thermal-cycler/
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