Cromatografía de filtración en gel - Definición, principio, tipos, partes, pasos, usos

Las biomoléculas se purifican mediante diferentes técnicas que las separan según las diferencias de sus propiedades específicas, como el tamaño, la hidrofobicidad, el biorreconocimiento, la carga, etc.

La filtración en gel es una técnica en la que la separación de los componentes se basa en la diferencia de peso o tamaño molecular.

Es la más sencilla y suave de todas las cromatografía y separa las moléculas en función de las diferencias de tamaño.

Principio de Cromatografía de filtración en gel

Fuente de la imagen: MBL Life Science.

Para realizar una separación, el medio de filtración en gel se empaqueta en una columna para formar un lecho compacto. El medio es una matriz porosa en forma de partículas esféricas que se han elegido por su estabilidad química y física, y su inercia (falta de reactividad y propiedades de adsorción). El lecho compacto se equilibra con un tampón que llena los poros de la matriz y el espacio entre las partículas. El líquido del interior de los poros se denomina a veces fase estacionaria y este líquido está en equilibrio con el líquido del exterior de las partículas, denominado fase móvil.

• La fase estacionaria utilizada es una matriz polimérica porosa cuyos poros están completamente llenos del disolvente que se va a utilizar como fase móvil.
• Las moléculas de la muestra se bombean a través de columnas especializadas que contienen dicho material de relleno microporoso (gel).
• La base de la separación es que las moléculas que superan un determinado tamaño quedan totalmente excluidas de los poros, mientras que las moléculas más pequeñas acceden al interior de los poros parcial o totalmente.
• Por lo tanto, el flujo de la fase móvil hará que las moléculas más grandes atraviesen la columna sin obstáculos, sin penetrar en la matriz del gel, mientras que las moléculas más pequeñas se verán retrasadas en función de su penetración en el gel.

Tipos de cromatografía de filtración en gel

Separaciones por grupos

• Los componentes de una muestra se separan en dos grandes grupos según el rango de tamaño.
• La separación en grupos puede utilizarse para eliminar contaminantes de alto o bajo peso molecular (como el rojo de fenol de los fluidos de cultivo) o para desalar e intercambiar tampones.

Fraccionamiento de alta resolución de biomoléculas

• Los componentes de una muestra se separan según las diferencias de su tamaño molecular.
• El fraccionamiento de alta resolución puede utilizarse para aislar uno o varios componentes, para separar los monómeros de los agregados, para determinar el peso molecular o para realizar un análisis de distribución del peso molecular.

Pasos de la cromatografía de filtración en gel

1. Las partículas esféricas del medio de filtración en gel se empaquetan en una columna.
2. La muestra se aplica a la columna.
3. El tampón (fase móvil) y la muestra se desplazan por la columna.
4. Las moléculas se difunden dentro y fuera de los poros de la matriz (también se describe como la partición de la muestra entre la fase móvil y la fase estacionaria).
5. Las moléculas más pequeñas se adentran más en la matriz y, por tanto, permanecen más tiempo en la columna.
6. Como el tampón pasa continuamente por la columna, las moléculas que son más grandes que los poros de la matriz no pueden difundirse en los poros y pasar por la columna.
7. Las moléculas más pequeñas se difunden en los poros y se retrasan en su paso por la columna.
8. La separación se produce a diferentes intervalos que van seguidos de la detección de los componentes.

Aplicaciones de la cromatografía de filtración en gel

• La filtración en gel desempeña un papel fundamental en la purificación de enzimas, polisacáridos, ácidos nucleicos, proteínas y otras macromoléculas biológicas.
• La filtración en gel también puede utilizarse para facilitar el replegado de proteínas desnaturalizadas mediante un control cuidadoso de las condiciones cambiantes del tampón.
• Se utiliza en los experimentos de fraccionamiento de proteínas.
• La técnica de filtración en gel también se utiliza en la determinación del peso molecular.
• Separación de azúcares, proteínas, péptidos, gomas y otros en función de su tamaño.
• Puede utilizarse para determinar la estructura cuaternaria de las proteínas purificadas.

Ventajas de la cromatografía de filtración en gel

• La filtración en gel es una técnica robusta que se adapta bien a la manipulación de biomoléculas sensibles a los cambios de pH, a la concentración de iones metálicos o cofactores y a las condiciones ambientales adversas.
• Una ventaja importante de la filtración en gel es que las condiciones pueden variarse para adaptarse al tipo de muestra o a las necesidades de purificación, análisis o almacenamiento posteriores sin alterar la separación.
• Las separaciones pueden realizarse en presencia de iones esenciales o cofactores, detergentes, urea, clorhidrato de guanidina, a alta o baja fuerza iónica, a 37 °C o en cámara frigorífica, según las necesidades del experimento.
• A diferencia de la cromatografía de intercambio iónico o de afinidad, las moléculas no se unen al medio cromatográfico, por lo que la composición del tampón no afecta directamente a la resolución (el grado de separación entre los picos).
• Tiempo de análisis corto.
• Separación bien definida.
• Bandas estrechas y buena sensibilidad.
• No hay pérdida de muestras.
• La pequeña cantidad de fase móvil requerida.
• El caudal se puede ajustar.

Limitaciones de la cromatografía de filtración en gel

• El número limitado de picos que pueden resolverse dentro de la corta escala de tiempo de la ejecución.
• Hay que realizar filtraciones antes de utilizar el instrumento para evitar que el polvo y otras partículas arruinen las columnas e interfieran con los detectores.
• Las masas moleculares de la mayoría de las cadenas estarán demasiado próximas para que la separación muestre algo más que picos amplios.

Referencias

1. http://kirschner.med.harvard.edu/files/protocols/GE_gelfiltration.pdf
2. Wilson, K., Walker, J. (2018). Principios y Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular (8 eds.). Cambridge University Press: Nueva York.
3. https://www.slideshare.net/asabuwangwa/gel-permeation-chromatography-gpc
4. http://www.materials-talks.com/blog/2016/08/30/an-introduction-to-gel-permeation-chromatography-in-30-minutes/
5. https://chromatography.conferenceseries.com/events-list/applications-of-chromatography
6. http://library.umac.mo/ebooks/b28050630.pdf
7. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5206469/